主題:HPLC

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HPLC填料

    目前液相色譜的填料主要為硅膠及其鍵合硅膠。硅膠的主要優點是柱效高,機械強度高,物理性質如孔結構、孔徑、比表面積和孔徑易于控制,通過表面改性可獲得多種功能固定相.在高效液相色譜的發展的過程中曾使用過大顆粒全多孔硅膠、表面多孔的顆粒、小顆粒全多孔硅膠。高效液相色譜使用中孔和大孔全多孔的硅膠。現代高效液相色譜填料絕大多數用鍵合的方法將活性基團接枝到基質上,全多孔硅膠是使用最為普片的基質。但硅膠基質存在如下缺點:

    (1)硅膠填料穩定pH范圍較窄,硅膠在溫和堿性條件下不穩定,在pH>8時徹底溶解。

    (2)堿性化合物在固定相上拖尾比較嚴重,甚至產生不可逆吸附;

    (3)在pH>4時,硅膠的去質子硅醇基(PKa為6~8)與生物分子的堿性部分發生非特異反應。因此,硅膠不能滿足部分化合物尤其是生物物質和堿性藥物的分離的要求。針對上述問題,可通過減少改進基質性能而限制這些缺陷,常用的辦法是提高氧化硅純度或對硅膠表面進行一些預處理,也可以通過用單體或聚合硅烷對硅醇基進行化學修飾而使表面活性降至最低。然而,在低pH值條件下,硅烷鍵會逐漸將水解,引起色譜性能改變。由于硅膠的化學不穩定性,合成既具有良好化學穩定性的新型色譜介質受到關注。如有機聚合物、氧化鋁、氧化鋯、石墨碳等受到重視。有機聚合物固定相機械強度不高,在流動相中會溶脹,微生物存在時易分解,耐高溫性能較差,色譜柱效比較低,難以進行梯度洗脫,因而其應用受到一定的限制.(tobecontinued)。

日期:2010年7月29日 - 來自[儀器安裝、維修與保養]欄目

HPLC系統:樣品鑒定和分離的工具

    高效液相色譜法(HPLC)已經從早期的色譜技術發展成為一種具有許多專門用途的精調處理方法了。這種技術可以廣泛地用于分離混合物樣品中的溶質——這對于辨認混合物樣品中的成分來說意義重大。例如,HPLC經常用于鑒定組織勻漿中出現的多肽的豐度。另外HPLC對少量樣品來說也十分有用,因為這種技術十分靈敏,而且不會破壞樣品,所以對于熱不穩定樣品來說比較安全。

  和其他類型的液相色譜一樣,HPLC操作流程首先是將樣品注入到裝有小顆粒填料的色譜柱(固相色譜柱)中。色譜柱的長度一般為5-30cm(近期更多的傾向于小型化),內直徑一般為1-9mm,內部填料顆粒的直徑為3-10mm。樣品在流動的液相中移動,液相可以根據樣品和分離物的性質來選擇不同的溶劑混合物。

  當液相流過柱子之后,樣品中的每一種成份會被分別洗脫;液流檢測器記錄下每一種洗脫的成分,從而能夠測量單個成分特有的保留時間。樣品中與固相相互作用較強的成分具有較長的保留時間,并且洗脫較遲;而與固相相互作用較弱的成分則保留時間較短,在色譜柱內流動更快,洗脫較早。

  如果要選擇HPLC系統,個人覺得必須首先了解你所需要的色譜柱的特性,這是由樣品的性質決定的。目前有許多種色譜柱:利用離子交換、分子篩、生物親和、和樣品的手性等等。同時也要根據所需的色譜層析規模來選擇合適的HPLC系統。總的來說,分析型色譜適合用于樣品中成分的鑒定和定量,通常在皮克到毫克的水平;而制備型色譜的則適合于獲得純化的分離樣品,通常在毫克到千克的水平。選擇時同樣也需要考慮選擇一種合適的檢測器,如紫外光,折射率、熒光和質譜檢測器等。以下是根據Biocompare網站選擇的目前市場上提供的HPLC系統的不同特點。

  色譜柱特性(Columncharacteristics)

  假如你想要尋找一個能分離復雜的混合物的色譜柱,Varian公司的新產品PursuitXRs也許對你就有很大的吸引力。該柱具有專門為特別高分離度的樣品設計的,由大小為100埃的硅珠形成的巨大表面面積(surfacearea)。Varian公司宣稱該柱子能夠分離復雜的混合物。據報道,PursuitXRs壽命十分長,注射樣品5000次后仍沒有降解的跡象。PursuitXRs系列有C-18,C-8和二苯基(Diphenyl)固相等色譜柱。

  檢測器和系統模塊(Detectorsandsystemmodularity)

  Waters公司研制出了新一代HPLC系統——Alliance,該系統是基于他們的2695型分離模塊(2695SeparationsModule)的基礎上開發的,該分離模塊能調節溶質和樣品的分別管理。2695能與Waters公司的全部HPLC色譜柱兼容,包括:IntelligentSpeedIS,Symmetry,XBridge,和XTerra柱等;同樣也與許多檢測器兼容,包括質譜等。溶劑管理系統能去除系統中的氣泡并且能根據所需的比例混合成4種溶劑,可以設定范圍為每分鐘50ul到5ml的流速程序。樣品管理系統的特點還包括注入樣品的體積的范圍為1微升到數百微升,另外該系統還包括了五個獨立的樣品carousel,能夠在運行一個樣品的carousel的同時準備另外一個樣品,大大的節約了時間。此外,Alliance系統還包括了一種色譜柱加熱器或者加熱器/冷卻器來控制溫度,并且當沒人看管時,能對色譜柱轉閥。除此之外Waters公司還提供了一種BreezeHPLC系統,包括了泵、檢測器、注樣器和軟件在內。為了使該系統具有用戶友好的界面,不同的HPLC類型都預安裝了Breeze系統(Breeze系統適用于教學和分析應用)。

  Cecil儀器儀表公司則是以其模塊HPLC系統為之自豪,該公司市場部的AdeKujore表示,他們能提供可以一系列檢測器,如可變的UV/可見光波長檢測器、雙重波長的可變UV/可見光檢測器、WaveQuest超快速掃描UV/可見光檢測器、掃描熒光檢測器、電導檢測器、電化學檢測器和折射率檢測器等。Cecil公司的產品同時還具有其他的一些特性,如能提供手動或者自動上樣操作;自動上樣裝置包括了全面的樣品預處理和樣品的溫度控制兩部分。此外,還具有樣品的自動柱后衍生化、樣品成分的收集和色譜柱溫度調節容易進行等優點。

  Shimadzu(島津)科學儀器公司也具有自己的模塊HPLC產品。該公司的主要HPLC系統為Prominence系列。該公司的產品經理CurtisCampbell說,他們的HPLC產品的關鍵部分包含了SIL-20A自動進樣器,可以進行最快的樣品注射(10秒注射10uL)和防止樣品過載——這正是Shimadzu公司為高通量HPLC提供的該產品的速度優勢:將該子送樣器的速度與Prominence系列泵的高分離度相結合,能給用戶提供一種目前市場上最高通量的HPLC系統。利用Prominence系統和2.2um的ShimadzuXR新型色譜柱可以在循環時間為23秒內進行梯度分離樣品。這種卓越的循環時間指標意味著Prominence系統在通量上能超過許多價格上更貴和提供更大壓力的HPLC系統。

  此外,Shimadzu公司的CBM-20控制系統則被譽為首個基于web網的HPLC控制系統——可以直接與實驗室的網絡連接。它基于XML語言的界面使得用戶能夠遠程設置、控制、監視和維護HPLC系統。該控制系統具有網絡服務器,用戶只要用IP地址連接就能監控HPLC儀器。同時該系統整合了安全和密碼特性。

  分離規模

  各個公司提供了不同的HPLC分離規模的選擇,Varian公司據稱以其提供的制備型HPLC為傲。他們的PrepStar和SepTech系統就是兩個例子。用戶可以根據你樣品的類型選用這兩種形式,對于毫克到克數量級樣品純化來說,可以考慮他們的小顆粒填料的固相色譜柱(直徑5-10um)高效系統;對于選擇分離數千克的純化樣品的經濟系統來說,可以考慮Varian公司的大顆粒填料作為固相(直徑為10-25um)的高通量系統。

  Agilent公司可以提供覆蓋任何分離規模、流速范圍從每分鐘1納升到100ml的HPLC系統。假如需要,還可以在同一個系統中同時實現這些目的。他們的1200SeriesLC系統是基于他們最暢銷的1100系列HPLC的基礎上開發的,它的穩定性和機動性確實值得一提的。

  Agilent公司的1200SeriesRapidResolution新系統是專門為提高效率設計的,它的運行時間(runtimes)可以低至0.5分鐘。同時它也可以運行傳統的方法。對于復雜的樣品,該公司提供了具有多泵和多檢測器裝置的多維系統。此外,Agilent1200SeriesHPLC-Chip/MS系統較適用于蛋白質組分析和小分子分析,與Agilent6000SeriesMS系統聯用可以提供更強有力的工具。其HPLC-Chip利用微流體技術(microfluidicst)主要用于確保HPLC系統根據芯片來工作,與MS系統聯用則成為一種便利和靈敏度高的LC/MS研究系統。

  和Agilent公司一樣,Nanostream也開發了一種應用微流體技術的小型芯片HPLC,可以用于分析樣品。該系統的好處包括只需小量的溶劑和樣品、最小化樣品損失和提高樣品分析能力24倍等。Nanostream公司的將小型HPLC技術與他們的Briocartridge捆綁在一起(Briocartridge系統由24種小型的液相色譜柱組成,可以平行運行24個樣品)。

  Nanostream公司還提供了多種長度的色譜柱。NanostreamCL系統是為高通量化學分析設計的,適用于樣品的純度、可溶性、和成分的穩定性的研究系統。該系統包括了一個為384孔板設計的8針上樣器和為96孔板設計的6針上樣器,利用24紫外光吸光檢測器進行檢測,還可以選用熒光檢測器。該系統還包括了一個板改變系統,能處理5096孔板或者384孔板。另外NanostreamLD系統是為檢測基于液相色譜基礎的酶分析而設計的;NanostreamCX系統則適用于制備用于隨后進行的質譜分析的色譜層析樣品。

日期:2010年7月8日 - 來自[儀器介紹與操作]欄目

淺談高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)

    液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相,稱為經典液相色譜法,此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。高效液相色譜法是在經典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜法,又因分析速度快而稱為高速液相色譜法。也稱現代液相色譜。

    HPLC鑒于HPLC應用在藥品分析中越來越多,因此每一個藥品分析人員應該掌握并應用HPLC。

    一、液相色譜理論發展簡況色譜法最早是由俄國植物學家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的,色譜法(Chromatography)因之得名。F后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法

    二、HPLC的特點和優點HPLC有以下特點:高壓——壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少HPLC與經典液相色譜相比有以下優點:速度快——通常分析一個樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內即可完成分辨率高,選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少,容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。

    三、色譜分離原理色譜法的分離原理是:溶于流動相(mobilephase)中的各組分經過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法高效液相色譜法按分離機制的不同分為:液固吸附色譜法液液分配色譜法(正相與反相)離子交換色譜法離子對色譜法分子排阻色譜法

    1.液固色譜法使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分,大多數用于非離子型化合物,離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。

    2.液液色譜法使用將特定的液態物質涂于擔體表面,或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相,分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。正相色譜法采用極性固定相,流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。反相色譜法一般用非極性固定相,流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛,據統計,它占整個HPLC應用的80%左右。

    3.離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂,緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

    4.離子對色譜法離子對色譜法常用ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10mmol/L的離子對試劑,在一定的pH值范圍內進行分離。5.排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中,滯留時間長;大分子量的化合物不能進入孔中,直接隨流動相流出。

    四、實例應用

    高效液相色譜法測定面粉中熒光增白劑熒光增白劑是衛生部嚴令禁止在食品中添加的制癌性物質。對混在面粉、面粉改良劑、面粉快速發酵粉等和食品添加劑中的檢驗、國家有定性及限量方法,但操作復雜,耗時長,為此,我們建立了簡便、快捷、靈敏度較好的高效液相色譜法。

    1.1 試劑:1熒光增白劑標準液33號0.1g,加水溶解,定容至100mL,(含熒光增白劑1.0mg/ml)2棕色瓶中保存使用時吸取上述標準溶液10mL,置于100mL容量瓶中,加水稀釋至刻度(相當于0.1mg/ml熒光增白劑)3甲醇

    1.2 儀器條件:流動相100%甲醇,測定波長365nm;流速靈敏度1.0AUFS

    1.3 操作步驟提取:將樣品粉碎,稱取5.0-10.0g于具塞三角瓶中,加50ml水,電動振蕩器振蕩30分鐘后,調節pH至中性,定容至100ml;,抽濾,棄去初濾液10ml,剩余濾液再經微孔膜(0.45μ)過濾,濾液待用。

    測定:分別取標準溶液及樣品提取液注入高效液相色譜,進行色譜分析,根據保留時間及峰面積定性、定量。現代的色譜分析方法在分離效率、分離和分析有機結合操作過程的自動化方面作了很大的改進。其中包括氣相色譜法和高效液相色譜法兩大類,它們已成為分離分析工作中最重要的方法。

日期:2010年7月8日 - 來自[色譜分析實例]欄目

HPLC用水

    HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到:

  1、專門的純水機或超純水機;

  2、去離子水重蒸;

  3、二次或三次重蒸水;

  4、采用類似家用的純水機;

  5、市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水;

  6、其它途徑

  不管采用何種途徑,配制流動相應用新鮮水,水質越高放置時間越短。

  理想的HPLC用水應為18.2Ω的超純水,并通過0.22um的濾膜,除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。

日期:2010年7月1日 - 來自[色譜入門]欄目

為什么HPLC柱柱壓過高

  柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的問題,您可按下面步驟檢查問題的起因。

  1.拆去保護預柱,看柱壓是否還高,否則是保護柱的問題,若柱壓仍高,再檢查;

  2.把色譜柱從儀器上取下,看壓力是否下降,否則是管路堵塞,需清洗,若壓力下降,再檢查;

  3.將柱子的進出口反過來接在儀器上,用10倍柱體積的流動相沖洗柱子,(此時不要連接檢測器,以防固體顆粒進入流動池)。這時,如果柱壓仍不下降,再檢查;

  4.更換柱子入口篩板,若柱壓下降,說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質,正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高,請與廠商聯系。

日期:2010年7月1日 - 來自[儀器安裝、維修與保養]欄目

HPLC|使用問題

  1.色譜柱中的流動相會排干嗎?

  不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形:不慎未及時補充流動相,泵將溶劑瓶中的流動相吸干了,HPLC系統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了?色譜柱還能使用嗎?事實上,如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干,并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣,泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體,而不能輸送空氣。

  相比之下,另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣,整個色譜柱干涸的情況不太容易發生,多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了,因揮發掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了,也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤,恢復到正常狀態。

  2.使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意什么問題?

  如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱,使用PEEK材料制成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連接;PEEK接頭不僅無需工具,手擰即可固定,而且容易調節錐箍之外的管路長度,方便與不同品牌或規格的色譜柱相連接。

  使用此類材料的管路需要注意的是:PEEK對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象,但PEEK遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力,但PEEK管只能耐受近4000psi(但多數HPLC應用系統壓力不會超過3000psi)。

  使用PEEK接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能,因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管,因而壓力太高時,可能會使接頭在管路上滑動而產生死體積或漏液。

日期:2010年7月1日 - 來自[儀器安裝、維修與保養]欄目

HPLC基礎知識培訓教程(一)


    I.概論

  一、液相色譜理論發展簡況

  色譜法的分離原理是:溶于流動相(mobilephase)中的各組分經過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

  色譜法最早是由俄國植物學家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的,色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

  液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相,稱為經典液相色譜法,此方法柱效低、時間長(常有幾個小時)。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography,HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography,HSLP)。也稱現代液相色譜。

  二、HPLC的特點和優點

  HPLC有以下特點:

  高壓—壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。

  高速—流速為0.1~10.0ml/min。

  高效—可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

  高靈敏度—紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

  HPLC與經典液相色譜相比有以下優點:

  速度快—通常分析一個樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內即可完成。

  分辨率高—可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

  靈敏度高—紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

  柱子可反復使用—用一根色譜柱可分離不同的化合物。

  樣品量少,容易回收—樣品經過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。

  三、色譜法分類

  按兩相的物理狀態可分為:氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC),其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC),它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動相(常用CO2),因其擴散系數大,能很快達到平衡,故分析時間短,特別適用于手性化合物的拆分。

  按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC,又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。(此外還有電泳。)

  按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。

  四、色譜分離原理

  高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

  1.液固色譜法使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分,大多數用于非離子型化合物,離子型化合物易產生拖尾。常用于分離同分異構體。

  2.液液色譜法使用將特定的液態物質涂于擔體表面,或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相,分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。

  涂布式固定相應具有良好的惰性;流動相必須預先用固定相飽和,以減少固定相從擔體表面流失;溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化;另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,現在已很少采用。現在多采用的是化學鍵合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

  液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

  正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。

  反相色譜法一般用非極性固定相(如C18、C8);流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛,據統計,它占整個HPLC應用的80%左右。

  隨著柱填料的快速發展,反相色譜法的應用范圍逐漸擴大,現已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離,常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會使硅膠溶解,太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。

  正相色譜法與反相色譜法比較表

  正相色譜法反相色譜法

  固定相極性高~中中~低

  流動相極性低~中中~高

  組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出

  從上表可看出,當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線(如氨基鍵合固定相)。

  3.離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架,在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換,根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

  緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外,它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度,進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大,則離子強度高,不利于樣品的解離,導致樣品較快流出。

  離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

  4.離子對色譜法又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。

  分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。

  分析酸性物質常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

  離子對色譜法常用ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10mmol/L的離子對試劑,在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。

  5.排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中,滯留時間長;大分子量的化合物不能進入孔中,直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物,如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

  被分離組分在柱中的洗脫原理:

 

日期:2010年6月4日 - 來自[色譜入門]欄目

HPLC基礎知識培訓教程(五)

  幾種檢測器的主要性能

 

UV

熒光

安培

質譜

蒸發光散射

信號

吸光度

熒光強度

電流

離子流強度

散射光強

噪音

10-5

10-3

10-9

 

 

線性范圍

105

104

105

 

選擇性

流速影響

 

溫度影響

 

日期:2010年6月4日 - 來自[色譜入門]欄目
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